کیت بررسی شکست DNA اسپرم

آنالیز روتین منی اولین روش در ارزیابی وضعیت باروری مردان است. این ارزیابی اطلاعات مفیدی را در خصوص تعداد، حرکت، مورفولوژی، میزان زنده بودن اسپرم‌ها، عملکرد گنادها و انزال در اختیار قرار می‌دهد. این ارزیابی اطلاعاتی از بلوغ کروماتین اسپرم که برای قدرت باروری اسپرم و رشد جنین ضروری است در اختیار قرار می‌دهد. نسبت اسپرم‌هایی با تراکم کروماتین غیر طبیعی در انزال می‌تواند باروری مردان را ارزیابی کند و ما را در تخمین احتمال باروری زوجین یاری کند. در روند اسپرمیوژنز هسته اسپرم به طور کامل سازماندهی مجدد می‌شود که منجر به تراکم کروماتین آن می‌شود. این تراکم در اثر جایگزین شدن هیستون‌ها بوسیله پروتئین‌های انتقالی و سپس بوسیله پروتامین‌ها ایجاد می‌شود.اختلال در بلوغ کروماتین اسپرم می‌تواند سبب آسیب پذیری DNA و مستعد نمودن آن برای شکست یا دناتوره شدن شود که اغلب با ناباروری و کاهش قدرت باروری مردان در ارتباط است. بنابراین ارزیابی بلوغ کرو ماتین اسپرم در کنار آنالیز روتین مایع منی می‌تواند سبب بهبود و تکمیل ارزیابی باروری مردان شود. روش‌های مختلفی جهت این ارزیابی وجود دارد که برخی از آن‌ها از دقت لازم برخوردار نیستند، در حالی که روش مورد استفاده در کیت SPDA KIT در عین سهولت انجام و عدم نیاز به تجهیزات گران قیمت از دقت و صحت بسیار بالایی برخوردار است.

اصول روش:

تمایل اتصال DNA به مواد فلوئورسانس در DNA اسپرم نرمال، تقریبا 5 برابر کمتر از کروماتین اسپرماتید‌های گرد است. این که به دلیل ساختار بسیار متراکم و مستحکم مولکول DNA اسپرم بالغ است که موجب عدم دسترسی لیگاندهای فلوئورسانس به شیار اصلی موجود در DNA کروماتین اسپرم می‌شود. جایگزینی هیستون‌ها با پروتامین‌ها در اسپرم بالغ منجر به عدم اتصال رنگ و عدم رنگ آمیزی اسپرم‌های دارای کروماتین بالغ در این روش می‌شود.

مواد و محلول‌های موجود در کیت:

محلول A: Fix

محلول B: Wash

محلول C: Permeabilize

محلول D: Equilibrate

محلول E: Label

محلول F: Stop Reaction

محلول G: Staining buffer

نمونه مورد نیاز:

نمونه منی تازه باید در ظرف استریل جمع آوری گردد. بعد از فرآیند نمونه گیری، آنالیز پارامترهای اسپرمی انجام شود و سپس از نمونه یک گسترش تهیه شود.

دستورالعمل استفاده از کیت:

کیت بررسی مرگ سلولی در اسپرم یک محصول دانش بنیان بومی است ک این کیت برپایه رنگ آمیزی فلورسنت طراحی شده است، بنابرین تمام مراحل آزمایش باید در مکانی تاریک یا کم نور انجام شود. در مراحل زیر به طور کامل و خلاصه همه مراحل انجام تست بیان شده است.

1- Fix: از محلول A برای فیکس کردن لام استفاده کنید (محلول A را برروی لام بریزید و مدت 20 دقیقه صبر کنید)

2- Wash: بعد از فیکس کردن لام محلول اضافی را دور بریزید و لام را با محلول B به مدت 5 دقیقه شستشو دهید.

3- Permeabilize: برای افزایش نفوذپذیری غشا سلول به مدت 3 دقیقه از محلول C استفاده کنید.

4- Wash: محلول اضافی را دور بریزید و لام را با محلول B به مدت 5 دقیقه شستشو دهید.

5- Equilibrate: 100  میکرولیتر از محلول D را به مدت 5 دقیقه برروی لام بریزید.

6- Label: 50 میکرولیتر از محلول E را برروی لام بریزید سپس لام را به مدت 60 دقیقه و داخل انکوباتور 37 درجه قرار دهید. توجه داشته باشید که تقریبا برای این کار بر روی لام ابعاد 5 میلیمتر را در نظر بگیرید.

*- برای جلوگیری از خشک شدن محلول بر روی لام به دلیل گرمای انکوباتور، حتما از کاور پلاستیکی استفاده کنید

7- Stop Reaction: بعد از مرحله شماره 6 لام را از انکوباتور خارج کنید، سپس در یک اتاق تاریک محلول اضافی را دور بریزید و از محلول F برای توقف واکنش در مدت زمان 5 دقیقه استفاده کنید.

8- Wash: بعد از مرحله شماره 7 در یک اتاق تاریک محلول F را کاملا دور بریزید و لام را با محلول B به مدت 5 دقیقه شستشو دهید.

9-Staining buffer: در این مرحله از محلول G برای رنگ آمیزی سلول‌های آسیب دیده استفاده کنید. سلول‌های قرمز رنگ آپوپتوز منفی و سلول‌های سبز رنگ آپوپتوز مثبت هستند.